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DNA重組實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)

DNA重組技術(shù)，是分子的生物學(xué)研究生需要掌握的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，DNA重組實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)如下：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康捏w外連接獲得重組分子，用于轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA重組技術(shù)是用內(nèi)切酶分別將載體和外源DNA切開(kāi)，經(jīng)分離純化后，用連接酶將其連接，構(gòu)成新的DNA分子。外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段用兩種不同的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端，這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組...

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PCR儀使用參數(shù)設(shè)定注意事項(xiàng)

PCR儀使用參數(shù)設(shè)定注意事項(xiàng)PCR儀使用參數(shù)設(shè)定不正確會(huì)影響到PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這主要表現(xiàn)在溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)上，如果溫度參數(shù)設(shè)置過(guò)高，延伸時(shí)間不夠都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，下面談?wù)勈褂肞CR儀參數(shù)設(shè)定時(shí)的注意事項(xiàng)：一、溫度和時(shí)間溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模...

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一種通過(guò)改造CHO 細(xì)胞提升抗體產(chǎn)量的新技術(shù)

丙酮酸羧化酶是細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體代謝途徑的重要元素，可以有效促進(jìn)能量代謝。在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)酵母胞質(zhì)丙酮酸羧化酶(PYC2)，可以增加丙酮酸流向TCA循環(huán)。增強(qiáng)的PYC2表達(dá)導(dǎo)致丙酮酸通量增加，從而使乳酸積累減少多達(dá)4倍，并顯著增加細(xì)胞密度和培養(yǎng)壽命。有了這個(gè)結(jié)果，與親本細(xì)胞相比，工程細(xì)胞的抗體表達(dá)顯著提高了70%，產(chǎn)品質(zhì)量也有所提高（約3倍）。通過(guò)PYC2工程改造提升細(xì)胞性能，在丙酮酸、葡萄糖、乳酸和細(xì)胞能量代謝方面具有均高于親代細(xì)胞的各種優(yōu)勢(shì)。PYC2工程改造原理和方法在補(bǔ)...

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核酸酶切反應(yīng)原理及注意事項(xiàng)

A載體和外源DNA的酶切一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握核酸的酶切操作原理；通過(guò)酶切獲得可進(jìn)行體外重組的載體和外源DNA。二、實(shí)驗(yàn)原理限制性?xún)?nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱(chēng)特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3')，有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類(lèi)酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱(chēng)軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'...

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質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)方法和步驟

質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)方法和步驟一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞：分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉(SDS)和TritonX-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或TritonX-100處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線(xiàn)性...

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