質(zhì)粒DNA酶切實(shí)驗(yàn)指南

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

檢測(cè)重組質(zhì)粒是否成功，外源片段是否正確插入到質(zhì)粒載體中。

二、實(shí)驗(yàn)原理：

限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類(lèi)： 第一類(lèi)（I型）限制性?xún)?nèi)切酶、第二類(lèi)（II型）限制性?xún)?nèi)切酶和第三類(lèi)（ III型）限制性?xún)?nèi)切酶。

現(xiàn)在商業(yè)化的內(nèi)切酶一般都是II型限制性?xún)?nèi)切酶，具有以下三個(gè)特點(diǎn)：

1. 識(shí)別位點(diǎn)的特異性：每種酶都有其特定的 DNA識(shí)別位點(diǎn)，通常是由 4，5，6或 7甚至更多個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。

2. 識(shí)別序列的對(duì)稱(chēng)性：靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。識(shí)別序列有一個(gè)中心對(duì)稱(chēng)軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀"都相同。

如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?/span>

5'…… GAA|TTC ……3'

3'…… CTT|AAG …… 5'

垂直線表示中心對(duì)稱(chēng)軸，從兩側(cè)“讀"核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG。

3. 切割位點(diǎn)的規(guī)范性： 雙鏈 DNA被酶切后，可形成粘性末端或平末端DNA分子。
粘性末端：交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵。

如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?/span>

5'…… G'AA|TT_C ……3'

3'…… C_TT|AA'G …… 5'

_和'表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成5'G………  5'.AATTC，3'CTTAA.和3'……...G二個(gè)DNA片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò)DNA連接酶的作用而“粘合"。　　　　　

平頭末端：在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。

如EcoRV 的識(shí)別位置是： 

5'…… GAT'|ATC …… 3'

3'…… CTA'|TAG …… 5' 　

'表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后形成5'…… GAT   ATC …… 3'和3'……CTA和 TAG……5'二個(gè)片段，這種末端同樣可以通過(guò)DNA連接酶連接起來(lái)。

三、實(shí)驗(yàn)試劑：

1. 質(zhì)粒DNA

2. 酶切緩沖液（TaKaRa）

3. 限制性?xún)?nèi)切酶（TaKaRa）

4. ddH₂O

5. TAE電泳緩沖液

6. 瓊脂糖

四、實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 在微量離心管中配置如下酶切體系：

2. 適宜溫度反應(yīng)3小時(shí)。

3. 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

五、注意事項(xiàng):

1. 質(zhì)粒酶切所用緩沖液參照試劑目錄選擇。單酶切選用產(chǎn)品附帶的緩沖液，雙酶切根據(jù)試劑目錄選擇最適緩沖液。

2. 一般1 μg質(zhì)粒至少加1 U酶，酶切體系中酶的體積不超過(guò)1/10。

3. 根據(jù)試劑目錄選擇最適酶切溫度。 

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