X-射線(xiàn)衍射法

X-射線(xiàn)衍射技術(shù)是鑒定蛋?質(zhì)結(jié)構(gòu)的?標(biāo)準(zhǔn)。XRD可以實(shí)現(xiàn)較?的分辨率，通?？梢赃_(dá)到1到2埃。因此，它可以提供?常詳細(xì)的原?級(jí)別的結(jié)構(gòu)信息。然?蛋?質(zhì)晶體的??對(duì)XRD來(lái)說(shuō)是?個(gè)很?的挑戰(zhàn)，因?yàn)椴皇撬械?質(zhì)都能夠形成?質(zhì)量的結(jié)晶。對(duì)于難以結(jié)晶的蛋?質(zhì)，獲得合適的晶體可能需要花費(fèi)?量時(shí)間和努?。這也就是為什么當(dāng)科學(xué)家解析出?個(gè)新的蛋?質(zhì)結(jié)構(gòu)通常都可以發(fā)CNS的原因。

蛋?質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的精度通常?“分辨率"來(lái)表示，單位為埃（?），分辨率衡量了衍射圖像以及計(jì)算電?密度圖時(shí)看到的細(xì)節(jié)?平。如果晶體中的所有蛋?質(zhì)都以相同的?式排列，形成?個(gè)晶體，那么其中所有的蛋?質(zhì)分?都會(huì)以相同的?式散射X-射線(xiàn)，使衍射圖能夠顯示出晶體的精細(xì)細(xì)節(jié)。 另???，如果晶體中的蛋?質(zhì)都略有不同，例如由于局部柔性或運(yùn)動(dòng)等產(chǎn)?了結(jié)構(gòu)差異，衍射圖案就不會(huì)包含那么多的精細(xì)的信息。分辨率值為1 ?左右的結(jié)構(gòu)屬于?分辨率結(jié)構(gòu)，其晶體是?度有序的，因此很容易在電?密度圖中看到每個(gè)原?。?分辨率?于3 ?的結(jié)構(gòu)僅顯示蛋?質(zhì)鏈的基本輪廓，原?的位置只能通過(guò)推測(cè)得知。不過(guò)，?多數(shù)由XRD解析的蛋?質(zhì)結(jié)構(gòu)都介于這兩極之間。

上圖為不同分辨率下的myoglobin蛋?的電?云密度圖，1.0 ?分辨率下的原?位置清晰可辨； 2.0 ?分辨率下雖然每個(gè)原?的位置已經(jīng)?法清晰辨認(rèn)，但氨基酸殘基整體的形狀仍然清晰， 可以?較準(zhǔn)確地確定原?位置；當(dāng)分辨率來(lái)到2.7 ?，氨基酸殘基的形狀已經(jīng)變得模糊，準(zhǔn)確 推斷原?位置具有較?困難；對(duì)于3.0 ?分辨率的結(jié)構(gòu)，?乎?法從電?云密度圖辨認(rèn)出殘基 的形狀，僅能看到此處有?個(gè)殘基存在。讀者可點(diǎn)擊此處的鏈接??觀察不同分辨率下的電? 云形狀：1A6M（1.0 ?）、106M（2.0 ?）、108M（2.7 ?）、1S0H（3.0 ?）。

核磁共振技術(shù)

核磁共振技術(shù)通過(guò)分析蛋?質(zhì)樣品中的信號(hào)來(lái)解析蛋?質(zhì)的結(jié)構(gòu)。需要利?特定的同位素標(biāo)記 ?法（如15N或13C標(biāo)記）將?標(biāo)蛋?質(zhì)中的?部分原?標(biāo)記上，再通過(guò)2D相關(guān)實(shí)驗(yàn)（如1H[1]15N HSQC或1H-1H COSY）確定原?間的連接關(guān)系及三維空間排布?；趯?shí)驗(yàn)測(cè)得的NMR數(shù) 據(jù)，使?計(jì)算?法和算法對(duì)蛋?質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)?計(jì)算和模擬，如分?動(dòng)?學(xué)模擬、模擬退?等得 到蛋?質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。

NMR的分辨率通常較低，且?般只能?來(lái)分析較?的蛋?質(zhì)?段的結(jié)構(gòu)，通過(guò)多次采樣來(lái)得 到溶液中蛋?質(zhì)的平均位置。然?，NMR對(duì)樣品的要求較為靈活，可以提供有關(guān)蛋?質(zhì)動(dòng)態(tài) ?為、柔性區(qū)域和構(gòu)象變化的重要信息。

冷凍電?顯微鏡技術(shù)

冷凍電?顯微鏡是近年來(lái)?速發(fā)展的技術(shù)，通過(guò)觀察蛋?質(zhì)的冷凍樣品中的電?顯微圖像來(lái)解析蛋?質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Cryo-EM技術(shù)不需要蛋?質(zhì)結(jié)晶。相反，它使?冷凍技術(shù)來(lái)固定溶液中的蛋?質(zhì)構(gòu)象，從?可以研究?晶態(tài)或?規(guī)則結(jié)構(gòu)的蛋?質(zhì)。在過(guò)去，Cryo-EM的分辨率不怎么?，通常只能達(dá)到??埃，僅能分辨出蛋?質(zhì)顆粒的?致輪廓。2017年的諾?爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson三位科學(xué)家，他們?nèi)叩?作極?地提?了Cryo-EM技術(shù)獲得的蛋?質(zhì)圖像分辨率。?前，Cryo-EM技術(shù)獲得的蛋?結(jié)構(gòu)可達(dá)到數(shù)埃的分辨率，能夠?致看出分?的輪廓與肽鏈?向。PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中使?Cryo-EM?法解析出的分辨率最?的蛋?質(zhì)已經(jīng)具有原?級(jí)的精度，分辨率達(dá)到了1.15 ?（PDBID：7A6A），不過(guò)，這些?精度的結(jié)構(gòu)僅占極?的?例，?部分結(jié)構(gòu)的精度還處于3-5 ?的中等分辨率下。

由于?需結(jié)晶，也不?解析復(fù)雜的核磁共振信號(hào)，Cryo-EM在?分?和超?分?的結(jié)構(gòu)解析上?常有優(yōu)勢(shì)，如?蛋?質(zhì)復(fù)合物、膜蛋?和病毒等。此外，Cryo-EM還能夠提供動(dòng)態(tài)過(guò)程的信息，如蛋?質(zhì)的構(gòu)象變化。

微晶電?衍射技術(shù)

除了以上提到的三種技術(shù)外，近年來(lái)?種新的結(jié)構(gòu)解析?法——微晶電?衍射（Micro-ED）——正?速發(fā)展起來(lái)。該技術(shù)可以快速、?分辨率的測(cè)定?分?化合物和?物?分?的3D結(jié)構(gòu)。其使?電?作為?射光束，在冷凍透射電鏡（cryo-TEM）上獲得電?衍射數(shù)據(jù)。由于Micro-ED采?電???光?作為射線(xiàn)，電?相?光?擁有更短的德布羅意波?，因此其與物質(zhì)作?的強(qiáng)度更強(qiáng)，能夠分析很?的晶體并達(dá)到很?的分辨率。通常Micro-ED只需使?約100納?的?晶體，在?分鐘內(nèi)就能完成數(shù)據(jù)采集。并且數(shù)據(jù)采集過(guò)程可以直接得到電?的相位信息，??需進(jìn)?相位重建。數(shù)據(jù)處理??，采?常規(guī)的XRD解析?具就能解析Micro-ED數(shù)據(jù)，這更近?步降低了其應(yīng)??檻。

    不過(guò)，Micro-ED并不太適合?尺?蛋?的結(jié)構(gòu)解析，其更適?于解析短肽以及?分?化合物。例如天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)解析或藥品?產(chǎn)中對(duì)API的分析等。?2013年應(yīng)?以來(lái)，已經(jīng)有數(shù)百篇Micro-ED相關(guān)的論?發(fā)表。

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