近些年來(lái)，隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)，以及DNA克隆和測(cè)序方法的發(fā)展，對(duì)大量質(zhì)粒載 體和重組子的需求也大大減少。
  在本方案中，通過(guò) 堿裂解法的放大（Birnboim and Doly 1979）,質(zhì)粒DNA可從清亮的細(xì)菌裂解物中通過(guò)含有 漠化乙錠的CsCl梯度離心來(lái)進(jìn)行純化。
  無(wú)論是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒還是低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，通過(guò)這種方法可以得到每毫升3?5^g 的DNA。重組子的質(zhì)粒一般產(chǎn)量較少，這取決于克隆的DNA片段的大小和特點(diǎn)。
材料
為正確使用本方案中的器材和危險(xiǎn)試劑，必須查閱相應(yīng)的材料安全數(shù)據(jù)表并咨詢所在機(jī)構(gòu)的環(huán)境衛(wèi)生和安全辦公室。
儲(chǔ)備溶液應(yīng)稀釋至適用濃度后使用。
試劑
瓊脂糖凝膠（見(jiàn)步驟8和19）
堿裂解液I<A>
若用柱層析進(jìn)一步純化所制備的質(zhì)粒DNA （見(jiàn)本章導(dǎo)言中"純化DNA的商業(yè)試劑盒”部分），無(wú)菌的堿裂解 液I在使用前可補(bǔ)充適當(dāng)體積的無(wú)DNA酶的RNA酶（20mg/mL,胰RNA酶），使終濃度為lOOpg/mL,若用其他 方法純化DNA,不推薦在此步驟中加RNA酶。
堿裂解液II<A>
現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫使用。
堿裂解液III<A>
用于篩選質(zhì)粒的抗生素
轉(zhuǎn)化了目的質(zhì)粒的細(xì)菌克隆
氯霉素（34mg/mL）（可選；見(jiàn)步驟4）
乙醇
異丙醇
溶菌酶（10mg/mL）
限制性內(nèi)切核酸酶
培養(yǎng)基（LB、YT 或者 Terrific Broth） <A>,預(yù)熱到 37°C
STE<A>,冰浴
TE （pH8.0） <A>
附加試劑
步驟8和步驟19需要第2章方案1中列出的試劑。步驟18需要柱層析所用材料（見(jiàn) 本章導(dǎo)言）。
設(shè)備
有蓋的培養(yǎng)瓶（125mL, 2L）
知楚搖床，預(yù)設(shè)到37°C
RC6 Plus離心機(jī)帶轉(zhuǎn)頭，合適容量（Thermo Scientific）
分光光度計(jì)
實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞制備

• 挑取轉(zhuǎn)化的細(xì)菌單菌落或用0.1?l.OmL單菌落的培養(yǎng)物，接種到30mL含有適當(dāng) 抗生素的培養(yǎng)基中（LB、YT或者Terrific Broth）o

為確保培養(yǎng)物通氣良好：
?試管的體積應(yīng)該至少比細(xì)菌培養(yǎng)物的體積大4倍。試管蓋要蓋得松些。
•培養(yǎng)物要在劇烈振蕩下培養(yǎng)。

• 在適當(dāng)?shù)臏囟群蛽u速下培養(yǎng)菌液直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期晚期（OD6oo約為0.6）。

• 在含有500mL的LB、YT或者Terrific Broth培養(yǎng)液（預(yù)熱到37°C ）及適當(dāng)抗生素 的燒瓶（2L）中接種25mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期晚期的菌液。將此培養(yǎng)液在37°C劇烈振蕩（300cycles/ min）,培養(yǎng) 2.5h»

最后菌液的ODao應(yīng)為0.4。由于不同菌株的生長(zhǎng)速度不同，可稍微延長(zhǎng)或縮短培養(yǎng)時(shí)間，使最終的OD值為0.4。

• 若質(zhì)粒為低或中拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在培養(yǎng)液中加2.5mL濃度為34mg/mL的氯霉素， 使其終濃度為170ng/mLo

A對(duì)于高拷貝數(shù)質(zhì)粒，不必添加氯霉素。

• 在 37°C 以 300cycles/min 振蕩 12~16h。

• 取部分菌液（1?2mL）到離心管中，4°C儲(chǔ)存。2700g離心15min以收集余下的近 500mL培養(yǎng)物。棄上清，倒置離心管使殘余上清流出。

• 用200mL冰預(yù)冷的STE重懸細(xì)菌沉淀，按步驟6所述重新收集細(xì)菌并儲(chǔ)存在-20°C。

• 采用方案1中的方法或使用商品化試劑盒，從步驟6中取出的1?2mL菌液中提取 質(zhì)粒，并釆用酶切和瓊脂糖電泳分析此少量制備的質(zhì)粒DNA,以確定大量培養(yǎng)菌液中獲得 的質(zhì)粒正確。

設(shè)置這種對(duì)照可能看上去有點(diǎn)過(guò)于謹(jǐn)慎，然而它可以避免發(fā)生某些難以挽回的、浪費(fèi)大量時(shí)間的錯(cuò)誤。
細(xì)胞裂解

• 將步驟7中凍存的細(xì)菌在室溫下放置5?lOmin使其解凍，用18mL （10mL）堿裂 解液I重懸。

如果步驟4中使用了氯霉素的菌液，則使用括號(hào)中的體積數(shù)。
10. 加2mL （ImL）新配制的10mg/mL溶菌酶。

• 加40mL （20mL）新配制的堿裂解液II。蓋上離心管蓋，輕輕顛倒數(shù)次，混 勻，室溫放置5~10min。

延長(zhǎng)超螺旋DNA暴露于堿的時(shí)間會(huì)使其不可逆變性，所產(chǎn)生的環(huán)狀卷曲DNA不能被限制酶切割，而且它在 瓊脂糖電泳中的遷移率為正常超螺旋DNA的2倍，難以被漠化乙錠染色。從細(xì)菌中用堿裂解法提質(zhì)粒時(shí)可能會(huì)看 到微量的這種DNA.

• 加20mL （15mL）冰浴冷的堿裂解液III。蓋上離心管蓋，輕輕地但振蕩混勻 （此時(shí)不應(yīng)再有兩個(gè)液相）。將離心管在冰上放置lOmino

在放置過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)由染色體DNA、高分子質(zhì)量RNA,鉀離子、SDS、蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁復(fù)合物一起形成的乳 白色沉淀。
在堿裂解液HI中最好使用乙酸鉀而非乙酸鈉，因?yàn)槭榛宜徕淃}比鈉鹽難溶•
13. 4°C用＞20 000g離心30min,讓轉(zhuǎn)子自動(dòng)停止，無(wú)須制動(dòng)。將上清輕輕移入量筒中， 棄去沉淀。
不能形成緊密沉淀的原因一般是加入堿裂解液II時(shí)沒(méi)有充分混勻（步驟ID.如果細(xì)菌碎片不能形成緊密的 沉淀，以20 OOOg再次離心15min,將上清移入干凈的離心管。轉(zhuǎn)移時(shí)可用4層紗布過(guò)濾上清，可以除去黏稠的基 因組DNA和蛋白質(zhì)沉淀。
質(zhì)粒DNA回收

• 量取上清體積，將其連同0.6倍體積的異丙醇一起移入一支干凈離心管中并將其 充分混勻，室溫下放置lOmin。

15. 在室溫下以12 OOOg離心15min回收核酸沉淀。
若在4莒離心會(huì)使鹽沉淀下來(lái)。

• 小心棄去上清，將離心管敞開(kāi)蓋，倒置于紙巾除去殘余上清。在室溫下用70%乙 醇涮洗管壁，倒掉乙醇，并除去管壁的液滴。將離心管開(kāi)口倒置于紙巾上使剩余乙醇揮發(fā)掉。

如果用干燥器或者真空干燥的方法干燥DNA沉淀，在某些情況下會(huì)使其難以溶解并可能變性（Svaren et al. 1987）.將沉淀在室溫下干燥10~15min使乙醇揮發(fā)就足夠，不會(huì)引起DNA脫水。

• 用3mL含有2.0卩g/mL無(wú)DNA酶的RNase A的TE （pH 8.0）溶解DNA沉淀。輕 柔振蕩溶液。將DNA保存于-20°C O

18. 質(zhì)粒DNA的純化可用商業(yè)樹(shù)脂進(jìn)行柱層析（如QIAGEN公司的QIA-prep）。
19. 用DNA測(cè)序及限制性酶切結(jié)合凝膠電泳分析確證質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。

疑難解答
問(wèn)題（步驟19）：由于質(zhì)粒毒性使質(zhì)粒DNA得率低（W1.0卩g/mL）。

解決方案：換成低拷貝數(shù)的質(zhì)?；驍y帶原核生物轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的載體。

問(wèn)題（步驟19）：在酶切前、后經(jīng)電泳只見(jiàn)很少或無(wú)DNA。
解決方案：在乙醇沉淀后，在步驟16中可能將核酸丟失。離心后馬上小心地去除乙醇, 如果離心管放置的時(shí)間太長(zhǎng)，DNA沉淀會(huì)與管壁分離。

問(wèn)題（步驟19）： DNA不能被限制酶切割。
解決方案：DNA不能切割，可能是沒(méi)有移去所有液體，在純化質(zhì)粒DNA的過(guò)程中， 有些成分阻礙限制酶的功能?？梢試L試以下建議：

• 在步驟6中移去所有液體。

• 在步驟7中移去所有STEo

• 在步驟16中移去所有液體。

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